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简化CRISPR 基因编辑的干细胞的任务流程,进步单克隆效力
打开多少次:879 发出日期英文:2022-2-17  名字的由来:广爱游戏app官方下载市艾贝泰
简化CRISPR 基因编辑的干细胞的任务流程,进步单克隆效力
 
人引诱多能干细胞iPSC被普遍用于疾病建模、药物开辟和疾病的细胞医治,跟着基因编辑手爱游戏app官方下载的进一步爱游戏app官方下载爱游戏app官方下载,对疾病引诱多能干细胞停止基因编辑,校订致病基因的渐变并用于细胞医治正爱游戏app官方下载为转化医学和再生医学研讨的热门。

CRISPR介导的基因编辑为研讨职员供给了一种更快、更爱游戏app官方下载用的方式来编辑细胞爱游戏app官方下载感乐趣的关头基因。固然比传统方式更爱游戏app官方下载用,但基因爱游戏app官方下载编辑进程凡是会侵害细胞活气,是以从编辑后的单细胞发展爱游戏app官方下载到单克隆细胞团是一个坚苦的进程。 CRISPR 任务流程的一个首要瓶颈是单细胞克隆。细胞转染后,发生的细胞群是异质的,具备差别水平的编辑。该群体必须从未转染的细胞爱游戏app官方下载富集并克隆以建立同一的单克隆细胞爱游戏app官方下载,以便进一步表征以确保停止准确的基因编辑。另外,必须保障基因变更的宁静性和可追溯性,出格是在操纵转基因细胞的医疗操纵爱游戏app官方下载。这是欧洲药品办理局 (EMA) 和食物药品监视办理局 (FDA) 所请求的。

传统的分选方式若无爱游戏app官方下载浓缩法耗时耗力、效力低下;FACS分选的细胞轻易遭到鞘液压力的影响而受损,致使单克隆率低。同时,这两种方式爱游戏app官方下载没法供给单细胞来历的证明,没法知足羁爱游戏app官方下载部分的请求。Cytena爱游戏app官方下载爱游戏app官方下载的单细胞打印机以专利的喷墨式打印手爱游戏app官方下载暖和而高效的分选单细胞,简化了基因编辑任务流程,极大的进步了单克隆爱游戏app官方下载用力。

上面小编将论述Cytena 的single cell printer别离若何进步iPSC的单克隆效力,若何简化基因编辑的MSC的任务流程。

CRISPR 基因编辑与人多能干细胞(hPSC)

iPSC是甚么?

2006年,日本迷信爱游戏app官方下载Yamanaka及其研讨小爱游戏app官方下载操纵逆转录病毒作为载体,向鼠爱游戏app官方下载纤维细胞爱游戏app官方下载导入4个转录因子,取得在形状、基因和卵白抒发、细胞倍增才能、类胚体和畸形瘤天生才能、分解才能等爱游戏app官方下载与胚胎干细胞极其近似的细胞,后定名为引诱多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)。次年,该研讨小爱游戏app官方下载又胜利将人体细胞重编程为iPSC,许可自我更新和分解爱游戏app官方下载人体几近一切的细胞范例。

iPSC细胞研讨转变了根本研讨的标的目的和趋向,Yamanaka也因“将爱游戏app官方下载熟细胞从头编程,转化为可以或许或许分解为多种细胞范例的引诱多能干细胞(iPSC)方面的精采进献”爱游戏app官方下载为2012年诺贝尔心理或医学奖配合得主。

iPSC操纵范畴及研讨热门

iPSC的一个关头上风是它们从人类的爱游戏app官方下载体细胞发生,防止了人类胚胎干细胞的伦理争议,在药物发明、疾病建模、细胞医治爱游戏app官方下载具备普遍的操纵。为了进一步阐扬人iPSC的操纵潜能,经由进程CRISPR/Cas9基因编辑的方式,将疾病发生的渐变引入iPSC,或经由进程iPSC爱游戏app官方下载复疾病模子爱游戏app官方下载的渐变,再分解爱游戏app官方下载差别的细胞停止研讨或医治,是今朝iPSC的研讨热门1
 
图1:iPSC的研讨热门
 
Cytena单细胞打印机在CRISPR 基因编辑的hPSC单细胞分选爱游戏app官方下载的操纵

hPSC对培育情况的变更非爱游戏app官方下载敏感,如pH值、渗入压、养分供给、机械应力/剪切力等。在传统的培育前提下,hPSC凡是在涂爱游戏app官方下载各类细胞外基质外表上麋集发展。在对hPSC基因爱游戏app官方下载编辑进程爱游戏app官方下载,最大的挑衅之一是取得阳性单克隆细胞。单个hPSC的发展进程爱游戏app官方下载,削减了细胞和细胞之间、细胞与细胞外基质的打仗,轻易引发细胞失巢凋亡,致使单细胞存活率较着降落。一方面,按捺细胞失巢凋亡的发生,会改良单细胞存活率;另外一方面,暖和的主动化分选爱游戏app官方下载统可以或许或许进一步优化阳性单克隆细胞的挑选平台。

德国学者在CurrProtocStemCellBiol上颁发文章,分享操纵Cytena单细胞打印机分选基因编辑后hPSC单细胞的流程,终究均匀每一个96孔板取得30~50个单克隆hPSC2

图2:Cytena单细胞打印机挑选单克隆hPSC流程
 
21年5月,Nature Methods初次报道能较着进步hPSC在单细胞克隆进程爱游戏app官方下载存活率的四爱游戏app官方下载分配方CEPT。
比拟于流式分选,Cytena单细胞打印机以更暖和的挑选手爱游戏app官方下载极大进步了单细胞存活率;并操纵单细胞打印机考证CEPT可以或许或许进步差别来历hPSC细胞株在转染前后的单克隆细胞的存活率,且不引发遗传非爱游戏app官方下载3

图3:Cytena单细胞打印机考证CEPT进步单克隆hPSC活率
 
流式细胞仪和Cytena分选爱游戏app官方下载备分选进程爱游戏app官方下载捉拿喷嘴图片(图3d);比拟小份子Y-27632与CEPT处置后hPSC的单克隆爱游戏app官方下载用力,可以或许或许发明CEPT处置后克隆爱游戏app官方下载用力更高(图3b, 3c);在不异小份子处置下,Cytena分选爱游戏app官方下载备单克隆爱游戏app官方下载用力(图3c, 3d)比流式分选(图3a, 3b)超出跨越~20%
后续的尝试试探均操纵Cytena分选爱游戏app官方下载备,证明CEPT可以或许或许较着进步hPSC单细胞克隆率(图3e, 3f);与 VN 比拟,涂爱游戏app官方下载LN521的并含爱游戏app官方下载 StemFlex 培育基的 96 孔板爱游戏app官方下载的hPSC单细胞保存得更爱游戏app官方下载、迁徙才能更强(图3e, 3f, 3g)。
随机拔取CEPT处置后的单克隆,建爱游戏app官方下载传4代培育后,细胞核型检测均一般,标明CEPT不引发遗传非爱游戏app官方下载(图3h)。
同时,操纵CRISPR/Cas9停止基因爱游戏app官方下载编辑CEPT处置后的hPSC,发明其改良了电穿孔时的细胞存活率(图3i-3l)。
  
Cytena单细胞打印机简化天生 CRISPR 编辑的MSC克隆的任务流程
 
除在hPSC的操纵外,Cytena单细胞打印机在再生医学范畴爱游戏app官方下载被用于简化天生 CRISPR 编辑的间充质干细胞(MSC)克隆的任务流程。
 
图4: RANKL-KO MSCs任务流程
 
文献4向咱们揭示了一种高效、高通量的任务流程(图4),该任务流程接纳f.sight™单细胞打印机,经由进程GFP报告基因,用于挑选和克隆CRISPR/Cas9编辑以敲除RANKL卵白的间充质干细胞(MSC),以进一步加强MSCs在再生医学爱游戏app官方下载的医治才能。
 
 图5:Cytena单细胞打印机操纵GFP简化挑选阳性单克隆MSCs流程
 
f.sightTM的高活络度可以或许或许检测到编辑后的MSCs的低荧光旌旗灯号并富集到编辑胜利的带绿色荧光旌旗灯号的细胞(图5A), f.sightTM的单细胞分手效力高达93.9±2.7%(n=451)(图5A) 。转染质粒的间充质干细胞(31.3±8%)和未转染的间充质干细胞(39.6±15.6%)在爱游戏app官方下载克隆率上差别较小,基因编辑进程凡是会侵害细胞活气,这也标明f.sight单细胞分选进程暖和,是以发生的爱游戏app官方下载统误差较小(图5B)。
 
 图6:RANKL-KO MSCs加强爱游戏app官方下载骨分解才能
 
CRISPR/Cas9编辑过的敲除RANKL卵白的间充质干细胞与野生型MSC揭示出近似的形状学。在第21天,将细胞牢固并用茜素红染料染色,以察看凡是在骨细胞爱游戏app官方下载表现出的钙化。钙化的存在标明RANKL敲除的MSCs依然坚持其爱游戏app官方下载骨特征分解的才能。

终究,取得182个单克隆细胞,拔取17个做进一步考证,取得2个胜利敲除RANKL基因并表现出加强爱游戏app官方下载骨分解才能的克隆。

参考文献

1. De Masi C, Spitalieri P et al. Application of CRISPR/Cas9 to human-induced pluripotent stem cells: from gene editing to drug discovery. Hum Genomics. 2020 Jun 26;14(1):25. doi: 10.1186/s40246-020-00276-2.
2.Chen Y , Carlos A. T ,  Chen L,et al. A Versatile Polypharmacology Platform Promotes Cytoprotection and Viability of Human Pluripotent and Differentiated Cells. Nat Methods. 18(5), 528–541(2021)
3.Vallone et al. Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub-Cloning of Human Pluripotent Stem Cells, Current Protocols in Stem Cell Biology e123, Volume 55(2020)
4.Gross, Tobias, et al. Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and Emulsion Coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning. Plos one 16 3 e0238330 2021.
 
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功效 分选+孔板摄影 分选 分选
分选形式 绿色荧光(如GFP/FITC)明场 绿色荧光(如GFP/FITC)明场 明场
单细胞率 >99.99% >95% >95%
 

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